M.Sporium 5 / MMOR FAD domain pET30a / (DH5a(DE3))
균주 / insert vector / competent cell
메탄균 : 메탄을 기질로 하여 산화시켜서 메탄올을 생성함.
MMOH-hydroxylase
MMOR-reductase
MMOB-inhibitor
DE3 를 쉽게 설명하기 위해 BL21 균주 에 대해 간략히 설명드리겠습니다.
단백질 발현에 사용되는 균주로 BL21 (DE3) 이 있습니다.
외부 단백질 발현에 사용되는 가장 대표적인 균주로서 ompT protease가 없어서,
생성되는 단백질에 큰 영향을 미치지 않는 장점을 지니고 있습니다.
* BL21중에서도 T7 RNA Polymerase가 있는 것은 특별히 DE3를 붙임
* BL21(DE3)는 그 자체가 자신을 죽일 수 있는 독성 단백질을 발현한다는 단점을 가지고 있다.
BL21 균주는 lac promoter에 T7 RNA polymerase를 가지고 있어서,
IPTG(단백질 과발현)로 lac promoter를 induction 시키면 T7 RNA polymerase가 만들어지고, 만들어진 polymerase가 expression vector-대표적인 pET series- 의 T7 promoter에 작용하여 vector에 있는 외부 유전자의 발현을 유도하게 됩니다.
BL21균주가 VECTOR에 자신의 유전자를 발현시킨다.
(여기서 유전자는 T7 RNA Polymerase. 이는 박테리오파지로부터 유래된 효소. 전사활성 높음. 상대 T7 Protomer에 매우 specific. 원하지 않은 단백질을 같이 발현시키는 경우를 막을 수 있음.)
이렇듯 두 가지의 단계를 거침으로서 IPTG를 사용하지 않은 상태, 즉 induction 이 되지 않은 상태에서는 발현을 줄이게 되거나 혹은 발현양을 늘릴 수 도 있습니다.
DE3 system 은 앞서 설명했던 발현 조절을 잘 하기 위해서
lambda bacteriophage 의 DE3 lysogen 이 발현되게 한 것입니다.
단백질 발현을 훨씬 더 엄격히 조절하기 위해
T7 lysozyme 을 encoding 하는 pLys plasmid 를 가진 BL21 (DE3) pLysS (적은 양의 T7 lysozyme발현) 와 BL21(DE3) pLysE (많은 양의 T7 lysozyme 발현) 가 있습니다.
이외에도 BL21 (DE3) 는 더 있습니다.
Prep. (Extraction) 과정
0. CELL 접종 하기 (Stock 넣기) - 전날 해야할 일
Stock은 -88도씨 냉장고(*521호 순수제조실)에 있음. 필요시 꺼내오면 되며, Stock을 만들었을시에도 냉장고에 보관
* 냉장고 층수별 있는 재고들... 정리 *
4층 : pellet
3층 : 정제
2층 : stock Labeling이 되어있으므로, 원하는 Stock을 찾도록 한다.
***아주중요 - 88도씨에서 바로 꺼내면 Cell이 놀랠수도 있으므로 얼음을 챙겨가서 꽂아서 가져오도록 한다.
본격적인 cell 접종 방법
1. 15 mL conical tube 에 + 5 mL LB Media
+ 5 μL Antibiotics Vector에 맞춰서 찾는다. pET30a 는 카나마이신 저항성을 가진다.
+ stock 10-30 μL를 넣는다 20 μL 정도...? 실험자의 직감에 의한.... 투여. 표면에 조금 넣어서 넣기.
2. 37도 200 rpm으로 O/N 시킨다. (12 ~ 16 hour)
* 커니컬 튜브는 실험실 맨 왼쪽 서랍에 있다.
1.Preparation of Cleared Lysate
1) 어젯밤에 O/N시킨 bacterial culture을 750 μL씩 2번 임피튜브에 넣는다.
이것을 무게 균형*(중요!!)을 맞춰서 원심분리기에 넣고 13500rpm 으로 1분 돌린다.
그리고 나온 상층액을 폐수 커니컬 튜브에 붓는다.
이렇게 하여 전날 키운 cell이 거의 없도록 3번 반복한다.
마지막에 상층액을 버릴 때에는 신중히 피펫(200 μL짜리)으로 뽑아내도록 한다.
* 피펫은 사용하기 전에 알코올 램프를 이용하여 소독하도록 한다.
* Conical tube의 폐기
15ml conical tube는 흐르는 물에 씻어서 뚜껑을 열어서 실험폐기물 통에 버리도록 한다.
그리고 Pellet은 냉장고가 있는 냉동실에 (-20도) 보관한다.
2) S1 Buffer 250 μL를 넣어준다.
잘 녹아 들어가도록 피펫팅을 통해서 을 녹여준다.
* Pipeting시에 기포가 발생하지 않도록 유의한다.
*S1 버퍼는 RNase A로써 내가 원하는 DNA만을 남기고 RNA를 없애준다.
*S1 버퍼는 4도씨 냉장고에 있으므로 하기 전에 꺼내놓도록 한다.
3) S2 Buffer 250 μL를 추가하고 4번 정도 inverting 시켜준다.(절대 VORTEX X)
*S2 Buffer는 세포벽을 깨주고,,,아무튼 다 깨주는 역할을 한다.
*Inverting은 느리게 뒤집어서 흔들어주는 것. 살살 다뤄줘야함
4) S3 Buffer 350 μL를 추가하고 4-6번 정도 inverting 시켜준다.
*S3 Buffer는 중화제로써 S2를 중화시켜주는 역할을 한다.
*S2를 넣은 상태에서 3분을 타이머 맞추고 기다린 뒤에 넣어주도록 한다.
5) Full-Speed로 10분 원심분리시킨다.
2.Centrifugation Protocol
1) 5번용액을 SV Column에 피펫팅을 하여 옮긴다. 그 뒤에 30초 동안 풀스피드로 원심분리시킨다.
그 뒤에 SV Column을 제거하고 아래에 남은 것을 버린다.
*SV에 넣을때에는 pellet 안 들어가도록 조심한다.
2) 옵션-AW Buffer가 없으므로 생략한다.
3) PW Buffer 700 μL를 넣고 30초 동안 Full-Speed로 원심분리시킨다.
그 뒤에 SV Column을 제거하고 아래에 남은 것을 버린다.
* PW은 에탄올이 섞여 있으며, 이 때문에 세척하는 역할을 담당한다.
4) PW Buffer를 제거 하기위해 1분 동안 원심분리시킨다. 이를 다시 1분동안 원심분리시킨다.
그러고 나서 SV컬럼만을 꺼내서 새로운 임피튜브에 끼워넣는다.
5) AUTO 증류수 40 μL를 SV Column의 필터지에 잘 적셔준다. 1분 정도 기다리고 1분 원심분리시킨다.
*1분 이상 더 기다려줘도 된다.
*AUTO 증류수는 4도씨 냉장고에 있다.
*DNA는 수용성이기 때문에 물에 잘 녹으므로 세척에 증류수가 용이함.
STOCK 만들기
1 ml stock을 만들려한다.
1 ml의 15%인 150 μL의 글리세롤과 나머지 850 μL를 cell로 넣어준다.
* 글리세롤은 점성이 너무 강하기 때문에 팁을 조금 잘라주어야한다.
* 에탄올을 가위에 뿌리고 알코올 램프로 지진 후 팁을 2-3cm 정도 잘라준다.
* 글리세롤은 실험대 서랍 위에 올려져 있다.
이후 글리세롤을 임피튜브 안의 cell에 넣어준다. 글리세롤이 잘 섞이도록 피펫팅 또는 인버팅 해주는데.
임피튜브는 작으므로 피펫팅을 해주고 15ml Conical tube 인버팅을 해주도록한다.
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